Die DNA -Polymerase ist ein entscheidendes Enzym in der molekularen Biologie, das eine zentrale Rolle bei DNA -Replikations- und Reparaturprozessen spielt. Im Labor ist die Reinigung der DNA -Polymerase ein sorgfältiger und mehrfacher Schrittprozess, der sorgfältige Planung und Ausführung erfordert. Als DNA -Polymerase -Lieferant bin ich gut mit den Feinheiten dieses Reinigungsprozesses vertraut, und ich möchte die Details mit Ihnen teilen.
Anfangsschritte: Zellwachstum und Lyse
Der erste Schritt zur Reinigung der DNA -Polymerase beginnt häufig mit wachsenden Zellen, die das Enzym exprimieren. Bakterien wie Escherichia coli werden häufig als Wirtszellen verwendet, da sie leicht zu kultivieren sind, schnell wachsen und genetisch konstruiert werden können, um die Ziel -DNA -Polymerase zu überexprimieren. Die Bakterien werden typischerweise in einem geeigneten Kulturmedium unter kontrollierten Bedingungen von Temperatur, pH und Belüftung gezüchtet. Zum Beispiel wird E. coli häufig bei 37 ° C in einer reichen Medium wie Luria - Bertani (LB) -Brühe kultiviert.
Sobald die Zellen eine angemessene Dichte erreicht haben, werden sie durch Zentrifugation geerntet. Das Zellpellet wird dann in einer Pufferlösung resuspendiert. Um die DNA -Polymerase aus den Zellen freizusetzen, wird ein Lyse -Schritt durchgeführt. Es gibt verschiedene Methoden zur Zelllyse, einschließlich mechanischer Methoden (z. B. Sonication), chemischen Methoden (unter Verwendung von Detergenzien wie Triton X - 100) und enzymatischen Methoden (unter Verwendung von Lysozym, um die Bakterienzellwand abzubauen). Die Bohrung ist eine beliebte Wahl, da sie die Zellen effektiv stören kann, ohne dass das Enzym erhebliche Schäden verursachen. Es muss jedoch sorgfältig kontrolliert werden, um zu vermeiden - die Probe zu erwärmen, was die DNA -Polymerase denaturieren könnte.
Vorbereitung und Klärung von Rohkoholextrakten
Nach der Zelllyse enthält das resultierende Gemisch eine Vielzahl von zellulären Komponenten, einschließlich Proteinen, Nukleinsäuren, Lipiden und Zelltrümmern. Dies ist als grobe Extrakt bekannt. Um die großen Maßstäbe zu entfernen, wird der grobe Extrakt mit hoher Geschwindigkeit zentrifugiert. Der Überstand, der die löslichen Proteine einschließlich der DNA -Polymerase enthält, wird sorgfältig gesammelt.
Manchmal kann der Rohstoffextrakt immer noch eine signifikante Menge von Nukleinsäuren enthalten, die die nachfolgenden Reinigungsschritte stören können. Um diese Nukleinsäuren zu entfernen, kann ein Niederschlagsschritt unter Verwendung einer polykationischen Verbindung wie Polyethylenimin (PEI) durchgeführt werden. PEI bindet an die negativ geladenen Nukleinsäuren, wodurch sie ausfällt, was dann durch Zentrifugation entfernt werden kann.
Chromatographische Reinigung
Die Chromatographie ist der Eckpfeiler der DNA -Polymerase -Reinigung. Es gibt verschiedene Arten von Chromatographie -Techniken, die verwendet werden können und jeweils auf unterschiedlichen Trennungsprinzipien basieren.
Ion - Austauschchromatographie
Ionen - Austauschchromatographie ist häufig der erste chromatographische Schritt im Reinigungsprozess. Es trennt Proteine basierend auf ihrer Nettogebühr. DNA -Polymerasen haben eine charakteristische Ladung bei einem bestimmten pH -Wert, der es ihnen ermöglicht, entweder an ein positiv geladenes (Anion - Austausch) oder negativ geladen (Kation - Austausch) Harz zu binden. Wenn beispielsweise die DNA -Polymerase bei einem bestimmten pH -Wert eine negative Nettoladung aufweist, kann ein Anion -Austauschharz wie Diethylaminoethyl (DEAE) -Cellulose verwendet werden. Der Rohextrakt wird auf die Säule geladen, und die DNA -Polymerase bindet an das Harz, während andere Proteine mit unterschiedlichen Ladungen durchlaufen. Die gebundene DNA -Polymerase kann dann durch Erhöhen der Salzkonzentration im Puffer eluiert werden. Diese Methode entzieht viele Kontaminanten wirksam und kann die DNA -Polymerase in der Probe erheblich anreichern.
Affinitätschromatographie
Die Affinitätschromatographie ist eine hochspezifische Reinigungsmethode. Es nutzt die spezifische Wechselwirkung zwischen der DNA -Polymerase und einem an einem Harz immobilisierten Liganden. Ein allgemeiner Ansatz ist die Verwendung eines His -Tag -Systems. Wenn die DNA -Polymerase genetisch so konstruiert wurde, dass sie ein Histidin -Tag (sein - Tag) enthält, kann ein Nickel -Nitrilotriakacesäure (Ni - NTA) Harz verwendet werden. Das His -Tag bindet speziell an die Nickelionen am Harz, sodass die DNA -Polymerase selektiv auf der Spalte aufbewahrt werden kann. Andere Proteine, die nicht das His -Tag haben, werden die Spalte durchlaufen. Die gebundene DNA -Polymerase kann durch Zugabe von Imidazol zum Puffer eluiert werden, der mit dem His -Tag um die Bindung an die Nickelionen konkurriert.
Eine andere Art von Affinitätschromatographie, die verwendet werden kann, ist die DNA -Affinität -Chromatographie. Da die DNA -Polymerase eine natürliche Affinität zur DNA aufweist, kann eine DNA enthalten, die Harz enthält. Die DNA -Polymerase bindet an die DNA am Harz, und andere nicht -DNA -Bindungsproteine werden entfernt. Die gebundene DNA -Polymerase kann dann eluiert werden, indem die Pufferbedingungen geändert werden, z. B. die Erhöhung der Salzkonzentration oder das Hinzufügen einer DNA des Wettbewerbs.
Größe - Ausschlussschromatographie
Größe - Ausschlusschromatographie, auch als Gel - Filtrationschromatographie bekannt, trennt Proteine basierend auf ihrer Größe. Die Säule ist mit porösen Perlen gefüllt. Kleinere Proteine können in die Poren der Perlen eindringen und einen längeren Weg durch die Säule haben, während größere Proteine früher durch die Räume zwischen den Perlen und den Elute gehen. Diese Methode ist nützlich, um verbleibende Aggregate oder kleine - molekulare Gewichtsverschmutzungen zu entfernen. Es kann auch verwendet werden, um das Molekulargewicht der gereinigten DNA -Polymerase zu bestimmen.
Endgültige Reinigung und Qualitätskontrolle
Nach den chromatographischen Schritten ist die DNA -Polymerase normalerweise stark gereinigt. Möglicherweise gibt es jedoch noch einige kleinere Verunreinigungen. Ein endgültiger Polierschritt wie die hydrophobe Wechselwirkungschromatographie oder die Rückwärts -Phasenchromatographie kann durchgeführt werden, um das Enzym weiter zu reinigen.
Sobald die Reinigung vollständig ist, sind strenge Qualitätskontrollmaßnahmen von wesentlicher Bedeutung. Die Reinheit der DNA -Polymerase kann unter Verwendung von Techniken wie Natriumdodecylsulfat - Polyacrylamid -Gelelektrophorese (SDS - Seite) bewertet werden. Ein einzelnes Band auf dem Gel zeigt eine hohe Reinheitsprobe an. Die Aktivität der DNA -Polymerase kann unter Verwendung eines In -vitro -DNA -Synthese -Assays gemessen werden. Die spezifische Aktivität, die die Menge der Enzymaktivität pro Proteineinheit ist, ist ein wichtiger Parameter, um die Qualität der gereinigten DNA -Polymerase zu bewerten.
Andere verwandte Enzyme und unser Produktportfolio
Zusätzlich zur DNA -Polymerase bietet unser Unternehmen auch eine Reihe anderer hochwertiger Qualitätsenzyme für die Laborforschung an. Zum Beispiel haben wir dasGP41 Protein 2.0, die eine wichtige Rolle bei DNA -Replikationsprozessen spielt. Ein anderes Produkt ist dasExonuklease III 2.0, was für DNA -Reparatur- und Modifikationsstudien nützlich ist. Und unserSC reca 2.0ist an homologen Rekombinationen und DNA -Reparaturmechanismen beteiligt.
Abschluss
Die Reinigung der DNA -Polymerase im Labor ist ein komplexer, aber lohnender Prozess. Durch sorgfältiges Zellwachstum, Lyse, chromatographische Reinigung und Qualitätskontrolle können wir eine hochreine und aktive DNA -Polymerase erhalten. Als DNA -Polymerase -Lieferant sind wir bestrebt, die höchsten Qualitätsprodukte bereitzustellen, um den Bedürfnissen der wissenschaftlichen Gemeinschaft gerecht zu werden. Wenn Sie an unserer DNA -Polymerase oder anderen Enzymprodukten interessiert sind, laden wir Sie ein, uns zur Beschaffung und weiteren Diskussionen zu kontaktieren. Wir sind immer bereit, professionelle Beratung und Unterstützung anzubieten, um sicherzustellen, dass Sie die besten Reagenzien für Ihre Forschungsprojekte haben.
Referenzen
- Sambrook, J. & Russell, DW (2001). Molekulares Klonen: Ein Laborhandbuch. Cold Spring Harbor Laboratory Press.
- Scopes, RK (1994). Proteinreinigung: Prinzipien und Praxis. Springer - Verlag.
- Deutscher, MP (1990). Leitfaden zur Proteinreinigung. Akademische Presse.