Grasgarnel ist eine wichtige wirtschaftliche Spezies in der chinesischen Süßwasser -Aquakulturindustrie. In den letzten Jahren jedoch dieHepatopankreas -Mikrosporidium(EHP), ein Parasit, der die Hepatopankreas der Garnelen infiziert, hat die Branche stark beeinflusst. Da es derzeit kein wirksames Arzneimittel oder Impfstoff zur Behandlung dieser Krankheit gibt, ist eine schnelle und genaue Erkennung von entscheidender Bedeutung, um ihre Ausbreitung zu verhindern.
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Qiao Yi, Shen Hui, Wan Xihe, Fan Xianping, Jiang GE, Li Hui, Wang Libao, Shi Wenjun, Cheng Jie. Isolierung und morphologische Beobachtung von Hepatopankreas -Mikrosporidium in Litopenaeus vannamei. Journal of Fishery Sciences of China, 2018, 25 (5): 1051-1058. Doi: 10.3724/sp.j.1118.2018.17430.
Der Nachweis von EHP beruht in erster Linie auf molekularen Biologiemethoden, wobei die PCR -Technologie am häufigsten ist. Während PCR eine hohe Empfindlichkeit bietet, benötigt sie teure PCR -Geräte und eine spezielle Laborumgebung, sodass sie für die Gebrauchsgebrauch nicht geeignet sind. Um dieses Problem anzugehen, entwickelte das Forschungsteam zwei Rapid -Erkennungsmethoden auf der Grundlage der MIRA -Technologie. Diese Methoden bieten eine hohe Empfindlichkeit, eine schnelle Reaktion und einen einfachen Betrieb, wodurch eine effiziente und schnelle Erkennung von EHP in Garnelen vor Ort ermöglicht wird, ohne dass komplexe Laborgeräte erforderlich sind, wodurch die Lücke bei den aktuellen Erkennungsmethoden gefüllt wird.
In der Studie verwendete Amplifikationsreagenzien:
- DNA -isotherme Schnellverstärkungskit (Basic)
- DNA -isothermisches Schnellverstärkungskit (kolloidaler Goldstreifentyp)
Die MIRA-Technologie ist eine multi-enzym isotherme schnelle Nukleinsäureamplifikationsmethode. Sein Kernprinzip beinhaltet die koordinierte Wirkung mehrerer funktioneller Proteine bei Umgebungstemperaturen, um eine schnelle Nukleinsäureamplifikation zu erreichen, wodurch ein wirklich tragbares Nukleinsäure-Nukleinsäure-Erkennung vor Ort ermöglicht wird.
Forschungsmethoden
Probenextraktion
Das Forschungsteam sammelte sowohl infizierte als auch gesunde Grasgarnelenproben von drei Garnelenfarmen in der Provinz Liaoning und extrahierte DNA aus der Hepatopankreas der Garnelen.
Primerdesign
Drei Sätze von miRA -Primern wurden auf das S8 Serin -Protein -Gen von EHP abzielen (GenBank -Zugangsnummer: auf 182063). Dieses Gen hat einzigartige aktive Stellen, die die Spezifität der Erkennung sicherstellen.
Mira-Age und Mira-LFD-Erkennung
(A) optimierte RPA-Age-Reaktionstemperaturen. M: DL 500 Marker; N: Negativkontrolle; Stämme 1-5: 25 Grad, 30 Grad, 37 Grad, 39 Grad und 42 Grad.
(B) optimierte Reaktionszeiten der RPA-Zeit. M: DL 500 Marker; N: Negativkontrolle; 1: 10 min; 2: 20 min; 3: 30 min; 4: 40 min.
(C) Optimierte RPA-LFD-Reaktionstemperaturen. N: Negativkontrolle; 1: 25 Grad; 2: 30 Grad; 3: 37 Grad; 4: 39 Grad; 5: 42 Grad.
(D) Optimierte RPA-LFD-Reaktionszeiten. N: Negativkontrolle; 1: 5 min; 2: 10 min; 3: 20 min.
Die beiden MIRA-Nachweismethoden, miRA-Alter (Agarosegelelektrophorese) und miRA-LFD (kolloidaler lateraler Fluss immunoassay), wurden verwendet, um EHP nachzuweisen. Das Forschungsteam optimierte die Reaktionstemperaturen und Zeiten durch Experimente. Mira-Age hat die Ziel-DNA in 30 Minuten bei 37 Grad verstärkt, während die miRA-LFD die Verstärkung in nur 10 Minuten bei 37 Grad abgeschlossen hat, wobei die Ergebnisse innerhalb von 5 Minuten lesbar sind.
Experimentelle Ergebnisse
Spezifität und Empfindlichkeit
(A) Spezifität der RPA-Age-Erkennung. M: DL 1000 -Marker; P: Nosema Bombycis; 1: EHP; 2: Enzephalitozoon; 3: microsporidia; 4: White Spot -Syndrom -Virus; 6: abnormal; N: Negativkontrolle.
(B) Spezifität der RPA-LFD-Erkennung. P: Nosema Bombycis; N: Negativkontrolle; 1: EHP; 2: Enzephalitozoon; 3: microsporidia; 4: White Spot -Syndrom -Virus; 6: abnormal.
(C) Empfindlichkeit von RPA-Alter mit Gradientenverdünnungen von rekombinanten Plasmiden. M: DL 500 Marker; N: Negativkontrolle; 1: 4,7 × 10^5 Kopien/µl; 2: 4,7 × 10^4 Kopien/µl; 3: 4,7 × 10^3 Kopien/µl; 4: 4,7 × 10^2 Kopien/µl; 5: 4,7 Kopien/µl; 6: 4,7 Kopien/µl.
(D) Empfindlichkeit von RPA-LFD mit Gradientenverdünnungen von rekombinanten Plasmiden. N: Negativkontrolle; 1: 4,7 × 10^5 Kopien/µl; 2: 4,7 × 10^4 Kopien/µl; 3: 4,7 × 10^3 Kopien/µl; 4: 4,7 × 10^2 Kopien/µl; 5: 4,7 Kopien/µl; und 6: 4,7 Kopien/µl.
Die Experimente zeigten, dass die MIRA -Technologie eine hohe Spezifität aufweist und EHP genau erfasst, ohne auf andere Krankheitserreger zu reagieren. In Bezug auf die Empfindlichkeit hatten beide Methoden eine Nachweisgrenze von 4,7 Kopien/µl, signifikant höher als die Empfindlichkeit der herkömmlichen PCR.
Klinische Probentests
Die Ergebnisse von Tests von 30 klinischen Proben zeigten, dass miRA-Alter und miRA-LFD eine Positivitätsrate von 70%aufwiesen, die etwas niedriger als qPCR von 80%, jedoch signifikant höher ist als die traditionellen PCRs 56,7%.
Anwendungsaussichten
MIRA-basierte Nachweismethoden ermöglichen eine schnelle Amplifikation von Zielgenen bei konstanten Temperaturen. Insbesondere kann die miRA-LFD-Methode in nur 10 Minuten Ergebnisse liefern, ohne komplexe Laborgeräte erforderlich zu machen, was es ideal für die Verwendung vor Ort in Garnelenfarmen ist. Die hohe Empfindlichkeit und Spezifität dieser Technologie macht sie zu einem effizienten Instrument zur frühzeitigen Erkennung und Kontrolle von EHP und schützt damit die Gesundheit und Entwicklung der Gras -Garnelenbauernindustrie.
Unter diesen Methoden ist der kolloidale Goldlateralfluss-Immunoassay (MIRA-LFD) aufgrund seiner Einfachheit und intuitiven Ergebnisse für Anwendungen vor Ort besonders gut geeignet. Gras -Garnelenbauern können EHP -Infektionen schnell erkennen und reagieren, die Krankheitskontrollkapazitäten verbessern, die Effizienz der Landwirtschaft erheblich steigern und die wirtschaftlichen Verluste verringern.