Hier etablieren wir sCRAM (Suboptimal Protospacer Adjacent Motiv (PAM)-vermittelte CRISPR-RNA und Cas12a-Nuklease kombiniert mit multienzyme isothermal rapid amplification), eine schnelle und extraktionsfreie Diagnoseplattform, die ASFV innerhalb von 20 Minuten erkennt. sCRAM integriert einen schnellen Nukleinsäurefreisetzungsschritt (40 Grad, 5 Min.) mit einer Ein-Röhrchen-Reaktion, die multienzyme isotherme Amplifikation (MIRA) und ein suboptimales PAM-vermitteltes CRISPR/ kombiniert.
Cas12a-System (37 Grad, 15 Min.), das eine instrumentenfreie visuelle Auslesung über UV-Licht oder Lateral Flow Strips (LFS) ermöglicht. sCRAM weist eine Empfindlichkeit für die Erkennung einzelner Kopien auf und zeigt keine Kreuzreaktion mit fünf häufigen Krankheitserregern bei Schweinen (PRRSV, PPV, JEV, PCV und PRV). Die Auswertung von 111 simulierten und klinischen Proben (einschließlich Blut, Plasma und Abstrichen) ergab eine 100 %ige Übereinstimmung mit qPCR für die UV-Auslesung und 98,20 % für LFS
Auslesung, wobei beide Methoden eine Spezifität von 100 % aufwiesen. Die Einfachheit, Geschwindigkeit und Feldanpassungsfähigkeit von sCRAM unterstreichen sein Potenzial für die dezentrale ASFV-Überwachung in ressourcenbeschränkten Umgebungen und bieten ein leistungsstarkes Tool zur Eindämmung von Ausbrüchen.
In dieser Studie haben wir sCRAM entwickelt, eine schnelle und vor Ort einsetzbare ASFV-Erkennungsplattform, die suboptimales PAM-vermitteltes CRISPR/Cas12a mit isothermer Multienzymamplifikation kombiniert. Der Assay erreicht innerhalb von 20 Minuten eine Einzelkopie-Empfindlichkeit von 1 Kopie/uL und zeigt keine Kreuz-reaktivität mit den wichtigsten Krankheitserregern von Schweinen. Die klinische Validierung von Blut-, Plasma- und Abstrichproben zeigte eine vollständige Übereinstimmung mit qPCR unter Verwendung von UV-Licht-Auslesung und einer Genauigkeit von 98,20 % über Lateral-Flow-Streifen. Mit vereinfachter Bedienung, hoher Sensitivität und Spezifität sowie visueller Ergebnisinterpretation bietet sCRAM ein großes Potenzial für die ASFV-Überwachung vor Ort und umfassendere Point-of-Care-Diagnoseanwendungen.
