Aeromonas hydrophila ist ein bedeutendes pathogenes Bakterium in der Aquakultur, das schwere Krankheiten bei Nutztieren verursacht und zu erheblichen wirtschaftlichen Verlusten führt. Um eine schnelle Erkennung vor Ort zu ermöglichen, haben wir eine tragbare Mikrofluidikplattform entwickelt, die die isotherme Schnellverstärkung mit mehreren Enzymen (MIRA) mit automatisierter Flüssigkeitshandhabung integriert. Das Chip-Design umfasste einen Miniatur-Vibrationsmotor und Keramik-Heizkissen zur Aufrechterhaltung
präzise Temperaturkontrolle und Gewährleistung der Reaktionshomogenität während der gesamten Nukleinsäureextraktion und -amplifikation. Für eine genaue Messung trieb eine Miniatur-Luftpumpe den DNA-Rohextrakt in einem einzigen Pipettierschritt durch den ChipQuantifizierung. Die extrahierte DNA wurde anschließend in eine mit MIRA vorbeladene Reaktionskammer überführtReagenzien für die isotherme Amplifikation bei 39 Grad unter Echtzeit-Fluoreszenzüberwachung. Diese Plattform wurde erkannt
A. hydrophila in Wasserproben innerhalb von 40 Minuten, wobei ein linearer Bereich von 1 × 10² bis 1 × 10⁷ KBE⋅ml erreicht wird−1und eine Nachweisgrenze (LOD) von 10 KBE⋅ml−1. Insbesondere ermöglicht das modulare Design einen einfachen Austausch von Primern und Sonden, wodurch die Plattform leicht an die Erkennung verschiedener bakterieller Krankheitserreger in der Aquakultur angepasst werden kann.
Schematischer Vergleich der tragbaren Mikrofluidikplattform und der herkömmlichen Detektionsplattform für A. hydrophila. (A) Die tragbare Mikrofluidik
Plattform. Der Detektionsworkflow auf dieser Plattform integriert Nukleinsäureextraktion, präzises Pipettieren, Amplifikation und Detektion. (B) Die konventionelle Erkennungsplattform. Der herkömmliche laborbasierte Arbeitsablauf ist auf hochentwickelte Ausrüstung, geschultes Personal und zeitintensive Verfahren angewiesen.
Stabilitätsbewertung der tragbaren Mikrofluidikplattform. (A) Foto der tragbaren Mikrofluidikplattform. (B, C) Wärmeleistung der Nukleinsäure-Extraktions- und Detektionskammern. Zusammenhang zwischen Keramikheizkissen und Kammertemperatur. (D) Stabilität der Fluoreszenzdetektion (N=3). Die Fluoreszenzintensität wurde während des gesamten Amplifikationsprozesses in 5-Minuten-Intervallen gemessen.
Leistungsbewertung der tragbaren Mikrofluidikplattform. (A) Kalibrierungskurve für den Nachweis von A. hydrophila (N=3). Eine Kalibrierungskurve wurde durch den Nachweis von A. hydrophila über einen Konzentrationsbereich von 1 × 101 –1 × 108 KBE⋅ml erstellt−1unter optimalen Bedingungen. (B) Bewertung der Chip-zu-Reproduzierbarkeit. Der MIRA-Assay für A. hydrophila wurde an zehn Chips durchgeführt, die aus jeweils zwei unabhängigen Formen hergestellt wurden. (C) Spezifitätsanalyse (N=3). Die Spezifität des MIRA-Assays wurde anhand der Zielbakterienarten A. hydrophila und 11 Nichtzielbakterienspezies validiert. (D) Vergleich mit qPCR (N=3). Sowohl die Plattform als auch qPCR wurden zum Nachweis von A. hydrophila in verschiedenen Konzentrationen verwendet. (E) Nachweis von Feld-isolierten Stämmen (N=3). Vier feldisolierte Stämme von A. hydrophila wurden sowohl mit der Plattform als auch mit qPCR nachgewiesen.