Staphylococcus haemolyticus ist ein grampositives Koagulase-negatives Bakterium, das in Krankenhäusern sehr häufig ist. In den letzten Jahren gab es aufgrund des hohen Risikos für Krankenhausinfektionen eine zunehmende Besorgnis. Staphylococcus haemolyticus kann weiterhin Hautinfektionen, Meningitis, Peritonitis und sogar Sepsis verursachen. Verzögerungen bei der klinischen Diagnose können zu einer Verschlechterung der Gesundheitszustände führen. Daher ist eine schnelle Diagnose von Staphylococcus haemolyticus eine genaue Behandlung.
Die Forschungsgruppe von Professor Ji Tuo vom Abteilung des Zentrallabors von Lianyungang Second People's Hospital veröffentlichte einen Artikel "Eine schnelle und visuelle Erkennung von Staphylococcus haemolyticus in klinischen Exemplaren mit Mira-LFs" in der Zeitschrift "Analytica Chimica Acta" mit einem Impact-Faktor von 6,2.
Überblick über die Studie
In dieser Studie etablierte die Gruppe von Prof. Ji Tuos Gruppe eine Methode zum Nachweis von Staphylolyticus haemolyticus durch miRA-LFs basierend auf dem MVAA-Gen und verwendete das Multi-Enzym-konstante Temperatur-Temperatur Rapid Nukleinsäureamplifikationstechnologie MIRA in Kombination mit lateralem Flusstest Strip LFs LFs. Das Experiment wurde nach 37 Grad durchgeführt und die Ergebnisse wurden innerhalb von 9 min mit einer Nachweisempfindlichkeit von 0. 147 CFU/Reaktion nachgewiesen. Das miRA-LFS-Nachweismethode ist für den Festpunktkennung von Staphylococcus haemolyticus in klinischen Proben geeignet und realisiert die Methode zur Identifizierung von Staphylococcus hämolyticus durch POCT, was von großer Wert für die schnelle Diagnose und Behandlung von Krankheiten in nicht versierten Gebieten von großem Wert ist. Die Forschungsgruppe verwendete miRA-LFS, qPCR und traditionelle Bakterienkulturmethoden zur Analyse von 95 zufälligen klinischen Proben und bestätigte die klinische Anwendbarkeit.
Forschungsmethoden
Ein schematisches Diagramm des miRA-LFS-Tests ist oben gezeigt. In dieser Studie wurden Ampfuture Biotech -DNA -Konstanttemperatur -Schnellverstärkungskit (kolloidaler Gold -Teststreifen) und Nukleinsäuretektionsteststreifen verwendet.
Die Primerlänge des MVAA -Gens betrug {30-35 Nukleotide, und die Länge des Amplifikationsprodukts war 100-350 bp und insgesamt 6 Paare von Kandidatenprimern wurden entworfen. Die GDNA von Standard -Staphylolytik -Staphylococcus -Stämmen wurde zur miRA -Analyse verwendet, Kandidatenprimer wurden untersucht und die amplifizierten Produkte wurden durch 2% Agarosegelelektrophorese visualisiert.
(Amplifikationsprodukte werden unter Verwendung von Agarosegelelektrophorese angezeigt)
Die Sonde wird dann gemäß der Vorwärtsprimersequenz (16 bp rückwärts) entworfen. Das 5 -' -Ende der Sonde ist mit FITC gekennzeichnet und das 3' -Ende ist mit C3 gekennzeichnet. Das Positionsnukleotid 31- in der Sonde wird in einem Abstand von 30 bp vom 5 'Ende und 15 bp vom 3' Ende ersetzt. Das 5' -Ende des ausgewählten Reverse Primers ist mit Biotin markiert.
(Schematisches Diagramm der Cross-Dimer- und Sequenzmodifikation von Primer-Probe-Kombinationen)
Zusätzlich wurden die Reaktionsbedingungen für den Nachweis von miRA-LFs durch Staphylococcus haemolyticus optimiert. Die Tests werden in 2 -minütiger Intervallen von {4-12 min von 37 Grad durchgeführt. Die Ergebnisse sind in der 8 -minütigen Reaktionszeit gezeigt und die Testlinie ist deutlich sichtbar. Zusätzlich wird der Test aus 22-52 Grad in 5 -Grad -Intervallen durchgeführt. 37-42 Grad ist die am besten geeignete Temperatur für die miRA-LFS-Erkennung. Daher betrug die optimale Reaktionszeit und Temperatur des miRA-LFS-Verfahrens für Staphylococcus haemolyticus 8 min bzw. 37 Grad. Zusammen mit der Tatsache, dass das Endergebnis von LFS innerhalb von 1 min visualisiert wird, beträgt die Gesamterkennungszeit 9 min.
(Optimierung der Reaktionszeit und Temperatur)
Experimentelle Ergebnisse
1. Empfindlichkeitsüberprüfung
Verschiedene Konzentrationen der genomischen DNA (gDNA), die aus seriellen Verdünnungen von Staphylococcus haemolytica-Kulturen (1 0^6-10^0 cfu/ml) erhalten wurden, wurden auf miRA-lfs getestet.
(Positives Signal bei unterschiedlichen Konzentrationen)
Die probabilistische Regressionsanalyse zeigte, dass der durch den miRA-LFS-Assay bestimmte 95% ige LOD 0. 147cfu/Reaktion war.
(Grenze der Erkennungsberechnung)
2. Spezifitätsvalidierung
Die Selektivität des miRA-LFS-Nachweiss wurde durch Analyse von 18 Stämmen häufiger pathogener Mikroorganismen und 15 Stämme klinischer Staphylococcus haemolyticus bestimmt. Die Ergebnisse zeigten, dass der miRA-LFS-Test für alle 18 anderen pathogenen Bakterien negativ war und für 15 verifizierte klinische Proben von Staphylococcus haemolyticus positiv war.
(8 Stämme von pathogenen Bakterien und 15 Stämmen des klinischen hämolytischen Streptokokkens wurden jeweils getestet)
Der miRA-LFS-Assay weist eine hohe Selektivität auf und ist für das Screening von Staphylococcus haemolyticus geeignet.
3. Tatsächliche Probentests
Insgesamt 95 Proben wurden zufällig aus dem Lianyungang Second People's Hospital entnommen, darunter 35 Proben aus Haut und Weichgewebe, 16 Urinproben, 14 Proben von Sputum und 30 Blutproben.
(95 klinische Proben wurden mit verschiedenen Methoden getestet)
Die Ergebnisse zeigten, dass die Nachweismethode zu 100% mit der QPCR -Methode übereinstimmte. Zusätzlich waren die Empfindlichkeit und Spezifität des miRA-LFS-Assays im Vergleich zum Goldstandard (GB/T4789. 11-2003) die Empfindlichkeit und Spezifität des miRA-LFS-Assays zur Identifizierung der Infektion von Staphylococcus haemolytica 100% bzw. 98,73%. Diese Ergebnisse validieren die technische Machbarkeit der Methode beim Nachweis von Staphylococcus haemolyticus in klinischen Proben weiter.
Die miRA-LFS-Methode wird zum schnellen Nachweis von Staphylococcus haemolyticus durch POCT verwendet, das effizient, genau, einfach und kostengünstig ist, was für schnelle Diagnose- und Behandlungsentscheidungen hilfreich ist.