Die heutigen molekularen diagnostischen Technologien entwickeln sich in einem beispiellosen Tempo mit erheblichen Fortschritten in den letzten zwei Jahren. Unter ihnen haben isotherme Verstärkertechnologien aufgrund ihrer Fähigkeit, eine Verstärkung durchzuführen, ohne spezialisierte Ausrüstung mehr Aufmerksamkeit auf sich gezogen. Es gibt mehrere bekannte isotherme Verstärkungsmethoden wie Lampe, RPA und RAA. Heute möchte ich jedoch eine neuere isotherme Amplifikationstechnologie-MIRA einführen.
Um sicherzustellen, dass jeder ein konsequentes Verständnis der Schlüsselkonzepte hat, finden Sie hier einige Begriff Erklärungen:
- Rekombinase-Polymerase-Amplifikation (RPA): Dies ist eine rekombinase-vermittelte Amplifikationstechnologie.
-Rekombinase-gestützte Amplifikation (RAA): eine ähnliche rekombinase-vermittelte Amplifikationsmethode.
- Loop-vermittelte isotherme Amplifikation (LAMP): eine weitere isotherme Amplifikationstechnik.
- Multienzym isotherme schnelle Amplifikation (MIRA): Eine neue isotherme schnelle Amplifikationstechnologie.
Schnelle Zusammenfassung und Klärung:
Viele fragen sich vielleicht, welche dieser verschiedenen isothermen Verstärkungsmethoden zuverlässiger und stabiler ist. In Wirklichkeit hat jede Technologie ihre Stärken und Einschränkungen. Die Schlüsselfaktoren für eine erfolgreiche Einführung sind jedoch die Fähigkeit, die Produktion zuverlässig, kostengünstige und robuste Leistung in verschiedenen Anwendungen zu skalieren.
Ich werde jetzt kurz jede Technologie basierend auf dem analysieren, was ich weiß:
LAMP (Loop-vermittelte isotherme Amplifikation):
Viele auf dem Gebiet wissen, dass die Lampe aus Japan entstanden ist und 2000 von Dr. Notomi als neuartige Genamplifikationstechnik entwickelt wurde. Derzeit gehört der Eigentum an dieser Technologie dem japanischen Unternehmen Eiken Chemical Co., Ltd.
Vorteile:
- Hohe Empfindlichkeit (2-5 Größenordnungen höher als herkömmliche PCR -Methoden).
- kurze Reaktionszeit (Reaktionen können in 30-60 Minuten abgeschlossen werden).
- Keine speziellen Instrumente im klinischen Gebrauch erforderlich (obwohl während der Kit-Entwicklung ein Turbidimeter in Echtzeit empfohlen wird).
- Einfach zu bedienen (unabhängig vom Nachweis von DNA oder RNA beinhaltet der Prozess das Mischen der Reaktionslösung, Enzyme und Vorlage in einem Reaktionsrohr und inkubiert dann bei 30-60 Minuten in einem Wasserbad oder Inkubator bei etwa 63 Grad, wobei die Ergebnisse durch das Nakedauge beobachtbar sind).
Nachteile:
- Eine hohe Empfindlichkeit kann zu einer Aerosolkontamination führen, sobald das Röhrchen geöffnet ist, so
- Das Primerdesign ist eine Herausforderung und macht es für einige Krankheiten ungeeignet, insbesondere für diejenigen, die durch Viren mit wenigen gemeinsamen Sequenzen verursacht werden.
- Die Anwendung ist relativ begrenzt.
RPA- und RAA -isotherme Amplifikationstechnologien:
Diese beiden Methoden sind weitgehend homolog, wobei der Hauptunterschied die Quelle der verwendeten Rekombinase ist.
- Die Rekombinase von RPA stammt aus dem T4 -Bakteriophagen.
- Raas Rekombinase stammt aus Bakterien oder Pilzen.
Schlüsselpunkte des Arbeitsprinzips:
1. In Gegenwart von ATP bindet die Rekombinase an Primer und bildet einen Protein-Nukleinsäure-Komplex, der dann nach der übereinstimmenden Ziel-DNA sucht.
2. Sobald der Primer die passende DNA -Template ermittelt, liefert die ATP -Hydrolyse die Energie für die Rekombinase, um den Primer zu hinterlassen, und die DNA -Polymerase synthetisiert einen neuen DNA -Strang.
3. Gleichzeitig binden einzeln Strängige DNA-Bindungsproteine (SSB) an den verschobenen DNA-Strang, um die Reformation des Doppelstrangs zu verhindern.
Vorteile:
- Die RPA/RAA -Reaktion ist sehr schnell, wobei die Ergebnisse in etwa 30 Minuten erreicht werden können.
- Empfindlichkeit kann 10 Kopien/μl erreichen.
- Während der Verstärkung sind keine komplexen Geräte erforderlich.
-Die Weiterentwicklung von Sondenbasis oder kolloidaler Goldchromatographie-Methoden vereinfacht die Ergebnisinterpretation erheblich und macht sie für die Verwendung in ressourcenbegrenzten oder wirtschaftlich benachteiligten Gebieten gut geeignet.
Nachteile:
- RPA ist eine Technologie, die vom britischen Unternehmen Twistdx entwickelt wurde, das jetzt Abbott gehört und zu hohen Kosten, langen Versorgungszyklen und mangelnden technischen Unterstützung führt. Dies erschwert eine groß angelegte Anwendung und Massenproduktion in China.
- RAA ist eine rein inländische Technologie, es fehlt jedoch die Stabilität in Bezug auf Interferenzresistenz und Konsistenz von Produktreagenzien. Darüber hinaus muss der Herstellungsprozess für funktionelle Enzyme verbessert werden. Obwohl die Technologie seit fünf Jahren auf dem Markt ist, wurde sie aufgrund von Stabilitäts- und Vielseitigkeitsproblemen noch nicht weit verbreitet.
- Sowohl RPA als auch RAA erfordern Primer, die 30-35 bp in Länge sind. Kürzere Primer beeinflussen die Spezifität, Sensitivität und Verstärkungsgeschwindigkeit und machen das Primer -Design herausfordernd.
Mira (Multienzym isotherme schnelle Amplifikation):
Mira ist eine neuartige isotherme Amplifikationstechnologie, die Mitte -2019 eingeführt wird. Es ist homolog für RPA und RAA.
Obwohl Mira Ähnlichkeiten mit RPA und RAA in Bezug auf Arbeitsprinzipien teilt, gibt es signifikante Unterschiede in der Enzymauswahl, Kultivierung, Reinigung und anderen Aspekten der großflächigen Produktion. Darüber hinaus hat das technische Team hinter Miras Entwickler AMPFUTURE fast 11 Jahre damit verbracht, die Technologie zu perfektionieren. Es ist nun voll ausgestattet, um die Entwicklung von Reagenzien, benutzerfreundlichen Reagenzien, kundenspezifischen Entwicklung, Forschungsprojekten und anderen anpassbaren Diensten zu unterstützen.
Vorteile:
1. Die funktionellen Proteine in miRA -Reagenzien stammen aus verschiedenen Enzymen, wobei einige Enzyme gezielte Modifikationen unterzogen werden, um die Effizienz des Kernenzymsystems zu verbessern, was zu einem umfassenderen System führt.
2. Starker Interferenzbeständigkeit und Stabilität. Die MIRA-Reagenzien werden hinsichtlich der Cofaktorauswahl und -konzentration zusammen mit dem Freeze-Trocknungs-Produktionsprozessen eine umfassende Optimierung durchlaufen, wodurch sie störender und stabiler sind.
3. Anpassung und Vielseitigkeit. Aufgrund der vollständigen Kontrolle über die Produktion von funktionellen Proteinen und eines tiefen Verständnisses der Technologie kann MIRA an verschiedene Anwendungen angepasst werden, wodurch verschiedene Reagenzsysteme und personalisierte Anpassungsdienste angeboten werden.
4. Proprietäre Patente. Da MIRA zu 100% im Inland entwickelt ist, besteht kein Risiko für eine Patentverletzung während der Produktentwicklung. Dies verschafft Mira einen Wettbewerbsvorteil sowohl in den inländischen als auch in den internationalen Märkten.
5. Es wurde ein komplettes Produktionsprotokoll eingerichtet, das eine stabile großflächige Produktion ermöglicht.
Nachteile:
1. Die Markterkennung ist immer noch niedrig, und es sind mehr Daten und Referenzen aus verschiedenen Bereichen (wie positive Raten in verschiedenen Bereichen) erforderlich, um eine breitere Akzeptanz zu erlangen.
2. Primer Design folgt immer noch den Eigenschaften von RPA oder RAA, die längere Primer- oder Sondensequenzen erfordern, die möglicherweise keinen schnellen Schalter für aktuelle PCR -Benutzer erleichtern.