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Zhang Minlin, Huang Fengqi, Zuo Xiaoling, Liang Jiantao, Liang Kaishan, Dan Jinhong, Li Zongyang, Yu Jie, Luo Liyuan, Xie Zijie, Zhao Huihong, Wang -Qing -Establishment eine Erkennungsmethode für eine große Mundmethode für eine große Mundmethode, die auf einer Krisen -Mund -Methode nach einer Krisen -Mund -Methode basiert. Chinese Journal of Hydrobiology, 2024, 48 (2): 283-291. Doi: 10.7541/2023.2023.0199
Micropterus Salmoides, auch bekannt als California Bass oder American Black Bass, ist ein in Nordamerika beheimatetes Süßwasserfisch. In den letzten Jahren ist es weltweit zu einem wichtigen Zuchtfisch geworden, da die Nachfrage auf hoher Marktmarke ein fester Marktnachfrage hat: Micropterus Salmoides hat ein festes Fleisch, nur wenige Knochen, einen köstlichen Geschmack, eine umfangreiche Ernährung, insbesondere das hohe Protein und das niedrige Fett, was die Nachfrage der Verbraucher nach gesunden Lebensmitteln entspricht. Daher ist der Marktpreis relativ hoch und wird häufig im High-End-Catering-Markt verwendet. Schnelles Wachstum: Micropterus salmoides wächst schnell und kann in 6-8 Monaten im Allgemeinen Warenspezifikationen erreichen. Es ist für die Kurzzyklus-Zucht geeignet und kann schnell Investitionsrenditen erzielen. Starke Krankheitsresistenz: Im Vergleich zu anderen Zuchtfischen hat Micropterus Salmoides eine starke Anpassungsfähigkeit an die Umwelt, weniger große Krankheitsausbrüche und reduziert die Zuchtrisiken. Ökologische Züchtung: Forellenbarsch können mit anderen Süßwasserfischen wie Silberkern und Graskarpfen gemischt werden, was dazu beiträgt, die ökologische Teichbalance zu erreichen und die Nutzung der Ressourcen zu maximieren, die Zuchteffizienz und andere Faktoren weiter zu verbessern. Es wird von Gästen und Aquakulturbauern begrüßt, und seine Zuchtskala ist in den letzten Jahren rasant gewachsen.
Obwohl Mikropterus-Salmoides relativ krankheitsresistent sind, können sie unter schlechten Brutbedingungen immer noch unter Krankheiten leiden. Unter ihnen ist Micropterus Salmoides Rhabdovirus (MSRV) äußerst schädlich: Es wurde 1991 erstmals in Florida, USA, entdeckt. Das Virus wurde ursprünglich in wilden Forellen -Bass -Populationen nachgewiesen und verbreitete sich dann allmählich auf viele Süßwasserseen und Reservoirs in den Vereinigten Staaten.
Klinische Symptome von erkrankten Fischen
A: Der gesunde Forellenbarsch zeigt den Pfeil auf den Eigelbsack; B: Erkrankter Forellenbarsch, der Pfeil zeigt den Eigelbsack an.
Die Übertragungsquelle ist oft infiziertes Fry- oder erwachsener Fisch, verschmutzte Gewässer und Wildfische, die das Virus tragen. Dieses Virus kann durch direkten Kontakt, Fäkalienausscheidung und Gewässer übertragen werden und tritt häufiger unter schlechten Wasserqualität oder züchtenden Zuchtbedingungen mit hoher Dichte auf. Diffusion. Das Virus kann Lethargie, Wanderung, Bauchschwellung und Körperverzerrung in jugendlichen Fischen verursachen und nekrotische Geschwüre und Multi-Organ-Blutungen induzieren. Nach der Infizierung übersteigt die Sterblichkeitsrate 90%.
Klinische Symptome von künstlich infizierten Mikropterus -Salmoides
A: gesunder Forellenbarsch; B, C, D: Künstlich infizierter Forellenbarsch.
Jedes Jahr gehen mehr als 30% der Micropterus Salmoides Fry aufgrund von MSRV verloren. Derzeit sind die Behandlungs- und Erkennungsmethoden für das Virus immer noch unreif, und es gibt keine spezifische Medizin zur Behandlung. Daher ist es sehr notwendig, das Virus vor der Infektion rechtzeitig zu erkennen und wirksame vorbeugende Maßnahmen zu ergreifen, die die Verluste des Zuchtprozesses bis zu einem gewissen Grad verringern können.
Darüber hinaus ist es schwierig, die Erkennung vor Ort ohne komplexe Erkennungsgeräte mit vorhandener Erkennungstechnologie durchzuführen. Angesichts dieser Herausforderung hat das Forschungsteam der South China Agricultural University eine neue Erkennungsmethode entwickelt, die Mira mit dem CRISPR-System kombiniert. Diese Methode hat eine starke Spezifität, eine hohe Empfindlichkeit und einen einfachen Betrieb, was die Erkennungseffizienz von MSRV erheblich verbessert und auch dazu beiträgt, MSRV so früh wie möglich zu erkennen und Präventions- und Kontrollmaßnahmen zu ergreifen.
Mira Primer -Kombinationsscreening
Zwei Paare verschiedener miRA -Primer wurden verwendet, um das Genfragment zu amplifizieren, das die Zielsequenz enthielt, und die amplifizierten Produkte wurden einer Agarosegelelektrophorese unterzogen. Das Elektrophorese-Diagramm befand sich an der Position von 100 bp, und in allen drei Fahrspuren traten helle Banden auf, was darauf hinweist, dass es nicht spezifische Verstärkungsprodukte gab. Die amplifizierten Zielbänder bei 250 bp in den Spuren 2 und 3 wurden jeweils mit der Bild -J -Software quantitativ analysiert, und die Ergebnisse der quantitativen Analyse wurden durch "Grauwert" ausgedrückt. Aus den Analyseergebnissen kann der Schluss gezogen werden, dass je niedriger der Grauwert ist, desto höher die Primernutzungsrate, dh die Primerspezifikationseffizienz.
Die Ergebnisse zeigten, dass die spezifische Bindungsamplifikationseffizienz hoch war, wenn das miRA-F2/R2-Primerpaar verwendet wurde.
Mira Primer -Paar -Screening -Elektrophorese -Gelbild und Grauwertanalyse
A. Elektrophorese Lane M: 2000 BP DNA -Marker; Elektrophoresespur 1. Negative DNA -Probenamplifikation; Elektrophoresespur 2. MiRA-F1/R1-Primerpaar verstärkt das Zielfragment (224 bp, wie in der Box gezeigt); Elektrophoresespur 3. miRA-F2/R2-Primerpaar verstärkt das Zielfragment (255 bp wie in der Box gezeigt); B. Bandgrauwertanalyse (wie im Box gezeigt)
CRISPR/CAS13A -Erkennungssystem
Nachdem die Reaktion des CRISPR/CAS13A -Nachweissystems abgeschlossen ist, wird es mit ultraviolettem Licht bestrahlt, um die Ergebnisse zu beobachten.
CRISPR/CAS13A-Erkennungssystem-Fluoreszenz-Helligkeitsdiagramm
1-3. Das gesamte System mit RNA -Standard hinzugefügt; 4. Keine crRNA hinzugefügt; 5. Kein Cas13a -Protein hinzugefügt; 6. Keine ssRNA -Reportersonde hinzugefügt; 7. Negativkontrolle
CRISPR/CAS13A-MSRV Optimales Reaktionssystem
Wir führten Experimente unter Verwendung von RNA -Standards und amplifizierten Proben -RNA durch. Die Positionierungsgeschwindigkeit der Ziel -RNA war mit crRNA2 besser als mit crRNA1. crRNA1 hatte ein stärkeres endgültiges Fluoreszenzsignal als crRNA2. Die gemischte Verwendung von crRNA 1+ crRNA2 in gleichen Anteilen könnte die Vorteile beider kombinieren und eine bessere Reaktionseffizienz erreichen.
Optimierung der CRISPR/CAS13A-MSRV-Detektionsreaktionsbedingungen und Erkennungsergebnisse
A. Vergleich der Nachweisergebnisse von Standard -RNA unter Verwendung von crRNA mit verschiedenen Abstandsabstandssequenzen;
B. Vergleich der Fluoreszenzsignaldaten von Standard -RNA, die vom Nachweissystem bei unterschiedlichen Temperaturen nachgewiesen wurden;
C. Vergleich der Fluoreszenzsignaldaten von Standard -RNA, die unter Verwendung von RNA -Reportersonden mit unterschiedlichen Konzentrationen nachgewiesen wurden;
D. Vergleich der Nachweisergebnisse von Standard -RNA, die unter Verwendung von Cas13a/crRNA -Sondenkomplexen mit unterschiedlichen Konzentrationsverhältnissen nachgewiesen wurden;
Um den Effekt der Reaktionstemperatur auf das Nachweissystem zu untersuchen, wurden unterschiedliche Reaktionstemperaturen von 31 Grad, 34 Grad, 37 Grad und 41 Grad festgelegt. Die optimale Reaktionstemperatur des CRISPR/CAS13A-MSRV-Detektionssystems betrug 37 Grad.
Um den Effekt der SSRNA -Reporter -Sondenkonzentration auf das Nachweissystem innerhalb des Testbereichs zu untersuchen, korrelierte die Fluoreszenzintensität positiv mit der SSRNA -Reporter -Sondenkonzentration. Der Nachweisffekt der SSRNA -Reporter -Sondenkonzentration war bei 500-700 nmol/l nicht viel unterschiedlich. In Anbetracht der tatsächlichen wirtschaftlichen Probleme betrug die optimale SSRNA -Reporter -Sondenkonzentration 500 nmol/l.
Um den Effekt verschiedener Cas13a- und crRNA -Reaktionskonzentrationsverhältnisse auf das Nachweissystem zu untersuchen, betrug das Verhältnis von Cas13a: crRNA 4: 1 und 3: 1, basierend auf dem Verhältnis von 100 nmol/l pro Abschnitt, Cas13a erreichte die Sättigung; Wenn die Menge an Cas13a konstant war, korrelierte die Intensität des Fluoreszenzsignals nicht positiv mit der Zunahme der Menge an crRNA. Wenn das Verhältnis von Cas13a zu crRNA 2: 1 beträgt, kann das CRISPR/CAS13A-MSRV-Nachweissystem eine maximale Nachweisaktivität erreichen.
Sensitivitätsbewertung
Um die minimale Erkennungskonzentration von MSRV durch das CRISPR/CAS13A-MSRV-Nachweissystem zu untersuchen, wurde der RNA-Standard in einer Reihe 10-mal verdünnt und vom CRISPR/CAS13A-MSRV-Detektionssystem nachgewiesen. Das CRISPR/CAS13A-MSRV-Detektionssystem kann mindestens 100 fm der MSRV-Ziel-RNA nachweisen. Wenn die Ziel -RNA -Konzentration unter 100 FM liegt, unterscheidet sich das von der Maschine nachgewiesene Fluoreszenzsignal nicht signifikant von der der Leer -Kontrolle. Daher kann das CRISPR/CAS13A-MSRV-Detektionssystem mindestens 100 FM MSRV-SSRNA nachweisen.
Bewertung der Spezifität des CRISPR/CAS13A-MSRV-Erkennungssystems für MSRV
Probentests
Bei kranken Fischproben mit offensichtlichen Anzeichen von Krankheiten, die von Seebassfarmen gesammelt wurden, verifizierten wir, ob der von dem kranke Fisch infizierte Erreger MSRV war. Wir verwendeten Primer, die für die MSRV -Capsid -Proteinsequenz spezifisch für die PCR -Amplifikation spezifisch sind, und schickten die entsprechenden Banden im Elektrophorese -Diagramm zum Testen. Nach dem Vergleich haben wir bestätigt, dass es sich um MSRV handelte.
Bestätigung von MSRV -Sequenzinformationen
A. PCR -Amplifikation von 228 BP -Produktbande von MSRV -Primern; B. MSRV-Capsid-Proteinsequenz im Vergleich zu NCBI, BOLD-Sequenzen sind stromaufwärts und stromabwärts-Primer-Bindungsstellen, und schattierte Bereiche sind Zielstellen für die CRISPR/CAS13A-MSRV crRNA1-Bindung
Die mit MSRV infizierten erkrankten Fischproben wurden für virale RNA vorbehandelt und vorverfolgt und dann mit der negativen Kontrollgruppe getestet. Gleichzeitig wurde die cDNA der Proben zum Vergleich mit herkömmlichem qPCR extrahiert. Die durch das CRISPR/CAS13A-MSRV-Nachweissystem nachgewiesenen positiven Proben (Nr. 3, 6, 7, 8, 9, 12, 13, 14 und 15) entsprachen den Ergebnissen des herkömmlichen qPCR, wobei der CQ-Wert von qPCR zwischen 18 und 25 war; Während die Schwellenzykluszahl negativer Proben (Nr. 1, 2, 4, 5, 9, 10 und 11) größer als 38 betrug, was darauf hinweist, dass die Proben kein MSVR -Virus trugen. Zusammenfassend waren die Erkennungsdaten des CRISPR/CAS13A-MSRV-Erkennungssystems und des herkömmlichen RT-QPCR konsistent, was darauf hinweist, dass das CRISPR/CAS13A-MSRV-Erkennungssystem machbar ist und die ursprünglichen konventionellen und komplizierten Erkennungsmethoden in gewissem Maße ersetzen kann.
Vertikales Vergleichsdiagramm der Stichproben -QPCR -Erkennungsdaten mit QPCR und CRISPR
A. qPCR -Nachweis des MSRV -Schwellenzyklus -Zyklus -Diagramms für klinische Proben; Die erkannte Probenzykluszahl wurde mit der negativen Referenzzykluszahl unter Verwendung der T-Tests-Analyse (** p verglichen<0.01);
B. Cas13a in Kombination mit miRA -Nachweis eines klinischen MSRV -Fluoreszenzdiagramms; Der nachgewiesene Probenfluoreszenzwert wurde mit dem negativen Referenzfluoreszenzwert unter Verwendung der T-Tests-Analyse (** p verglichen<0.01)
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die in dieser Studie festgelegte CRISPR/CAS13A-MSRV-Erkennungsmethode keine teuren experimentellen Instrumente erfordert, wodurch die Erkennung vor Ort schnell, genau und bequem ist. Wenn diese Nachweismethode verwendet wird, um im tatsächlichen Zuchtprozess rechtzeitig MSRV zu entdecken und gezielte und effektive Maßnahmen zu ergreifen, kann sie die durch Krankheiten im Zuchtprozess verursachten Verluste erheblich verringern. Darüber hinaus ist diese Erkennungsmethode schnell, hochempfindlich und spezifisch und verfügt über großartige Anwendungs- und Promotion -Perspektiven.