Das RPA-CRISPR/Cas12a-System in dieser Studie ermöglicht einen schnellen (30–40 Minuten) und ultra{4}empfindlichen (1 Kopie/μL) HCMV-Nachweis, indem es auf das früh-exprimierte UL123-Gen abzielt und damit herkömmliche Methoden bei klinischen Probentests übertrifft. Diese Innovation ermöglicht die rechtzeitige Diagnose von Infektionen mit geringer Viruslast, insbesondere bei immungeschwächten Patienten, und unterstreicht die Machbarkeit einer CRISPR-basierten Diagnostik zur Verbesserung des Managements von HCMV-bedingten Krankheiten. Die Einfachheit und Effizienz des Assays unterstreichen sein Potenzial als Point-of-Care-Tool für ressourcenbeschränkte Umgebungen.
Muster von RPA-Amplifikationsstellen und Kit-Auswahl.
(A) RPA-Primerdesign hinsichtlich der Position von Amplifikationsfragmenten. Pfeile geben die Basenpositionen vom Anfang bis zum Ende des amplifizierten Fragments mit den P1-P6-Primern an.
(B) Das Agarose-Gelelektrophoresebild des RPA-Produkts, verstärkt mit 6 HCMV-Primersätzen.
(C) Screening der Amplifikationseffizienz von RPA-Kits verschiedener Unternehmen. P: Primer, NC: Negativkontrolle.
Die Ergebnisse zeigten, dass das AmpFuture-Kit die höchste Verstärkungseffizienz aufwies.
Vergleich der positiven Raten von MIRA-CRISPR/Cas12a, PCR - Fluorescent Probe Method und qPCR in klinischen Proben.
Wir haben Blut- und Urinproben von 48 klinischen Patienten gesammelt. Aus diesen Proben wurde mit dem TIANamp Genomic DNA Kit genomische DNA extrahiert und die Ergebnisse des UL122-Nachweises mit der PCR-Fluoreszenzsondenmethode analysiert. Beim Vergleich unserer Ergebnisse mit klinischen Diagnosen identifizierten unsere Methoden 6 positive Proben, die in klinischen Tests negativ waren.
